Разработка хемилюминесцентного метода подбора иммуноактивных препаратов для персонифицированного лечения пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями

[19 января 2013]

Иммунная система в связи с ее функциональными задачами участвует прямо или опосредованно в развитии практически всех заболеваний. Особенно важно состояние иммунной системы при инфекционно-воспалительных заболеваниях [1; 2]. Без нормализации работы иммунной системы невозможно окончательное выздоровление больного. В настоящее время для категории пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями не возникает вопросов о необходимости проведения иммуноактивной терапии. Современные достижения иммунологии и других смежных специальностей, разработка новых иммуноактивных препаратов позволяют врачу оказать реальную и долговременную помощь больному с иммунными нарушениями. Однако эффективность применения иммуноактивных препаратов при лечении инфек­ционно-воспалительных заболеваний не всегда оказывается высокой. Связано это с тем, что, во-первых, диагностика нарушений в системе иммунитета является одной из наиболее трудных проблем врача и до настоящего времени еще во многом не оптимизирована, во-вторых, широкий спектр иммуноактивных препаратов затрудняет их выбор для конкретного пациента. В связи с этим появляется необходимость в разработке персонифицированного метода подбора иммуноактивных препаратов.

Оценка чувствительности пациента к иммуноактивным препаратам не может быть адекватной без использования критериев, характеризующих функ­циональную активность нейтрофильных гранулоцитов крови — одной из основных систем, обеспечивающих морфологический гомеостаз и защитные реакции организма. Состояние реактивности нейтрофилов имеет важное значение при самых разных заболеваниях, особенно связанных с воспалительными процессами [3-5]. Одним из наиболее перспективных методов, позволяющих оценить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ.

Хемилюминесцентный анализ позволяет получать информацию о нативном состоянии и функциональной активности клеток. Установлена возможность непосредственного исследования клеточного ответа при воздействии физиологических и патологических агентов [6-9]. Доказан высокий уровень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом [9].

В связи с этим, определение хемилюминесценции нейтрофилов может использоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцитозу. Уровень хемилюминесценции нейтрофилов характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие (супероксидный анион-радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.).

Таким образом, целью исследования явилась разработка хемилюминесцентного метода подбора иммуноактивных препаратов для персонифицированного лечения пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями.

Объект и методы исследования. Обследовано 130 пациентов, обратившихся в клиническое отделение лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (г. Красноярск), с инфекционно-воспалительными заболеваниями (рецидивирующий фурункулез, хронический гайморит, вялотекущий рецидивирующий аднексит, хронический вирусный гепатит В и С, рецидивирующий герпес). Перед назначением иммунотерапии проводили оценку индивидуальной чувствительности к иммуноактивным препаратам методом люцигенин-зависимой хемилюминесценции и делали прогноз эффективности терапии. Использовали следующие иммуноактивные препараты: циклоферон, тимоген, реаферон, галавит, полиоксидоний. Все пациенты в процессе лечения регулярно контролировались.

Параметры люцигенин-зависимой хемилюминесценции оценивались на анализаторе биохемилюминесцентном БЛМ-3607 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН). Результаты хемилюминесцентного анализа характеризовали по следующим параметрам: времени выхода на максимум интенсивности (Ттах), максимальному значению интенсивности (Imax) и площади (S) под хемилюминесцентной кривой. Предварительно определяли оптимальное количество крови для анализа.

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Me) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75). Различия между показателями контрольной и модифицированной иммуноактивными препаратами хемилюминесцентных кривых определяли по U-критерию Вилкоксона. Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft Inc., 2004).

Результаты и обсуждение. С целью упрощения процесса пробоподготовки и возможности его реализации в клинико-диагностической лаборатории, раз­работанный метод реализован на цельной крови обследуемого. Эго связано с тем, что клетками крови, которые производят подобные высокоэнергетические молекулы, являются только нейтрофильные гранулоциты [10].

Нейтрофильные гранулоциты обладают высокой реактивностью, они способны быстро функционально перестраиваться в ответ на воздействие агентов раз­личной природы. Кроме того, после активации нейтрофильные гранулоциты сами становятся мощными эффекторами каскадных реакций, определяя развитие воспаления и проявление цитотоксической активности данной клеточной популяции [1; 2; 10]. Помимо этого, нейтрофильные гранулоциты несут на своей поверхности специфические рецепторы к различным веществам, что делает возможным оценивать влияние иммуноактивных препаратов на эти клетки в экспериментах invitro. На рисунке представлена хемилюминограмма пациента А. при разном объеме крови. Исходя из результатов анализа зависимости интенсивности хемилюминесценции от объема крови в пробе, для разрабатываемого метода выбран объем в 25 мкл. Оптимальность данного объема крови для проведения хемилюминесцентного анализа определяется соотношением количества нейтрофильных гранулоцитов и эритроцитов в хемилюминесцентной пробе. При слишком большом количестве эритроцитов интенсивность свечения крови снижается за счет поглощения квантов света эритроцитами, при низком количестве нейтрофильных гранулоцитов интенсивность свечения также будет низкой.

При разработке метода также учитывались имеющиеся аналоги.

Известен способ подбора иммунокорректора и прогнозирования эффективности иммунотерапии при урогенитальных инфекциях, включающий проведение индуцированного НСТ-теста, в котором используют иммунотропные средства [11]. Учет реакции осуществляют на спектрофотометре, последова­тельно определяя показатели оптической плотности контрольной и всех опытных проб. Рассчитывают индекс чувствительности для каждого препарата и при индексе, равном или превышающем 1,3, прогнозируют эффективную иммунотерапию, а для лечения выбирают препарат с максимальным индексом чувствительности. Известный способ имеет следующие недостатки: способ является весьма трудоемким (выделение лейкоцитарной взвеси, постановка спонтанного и индуцированного НСТ-теста); для учета результатов НСТ-теста используют спектрофотометр, однако этот метод регистрации обладает низкой чувствительностью и имеет большую ошибку в учете результата за счет преданалитического этапа.

Известен способ хемилюминесцентной оценки чувствительности к интерферону у больных раком почки, в котором при исследовании крови invitroо чувствительности к интерферону судят по отклонению индекса чувствительности (ИЧ) от 1,0 [12]. ИЧ представляет собой отношение индекса активации нейтрофильных гранулоцитов при воздействии интерферона к индексу активации нейтрофильных гранулоцитов без интерферона. ИЧ выше 1,0 свидетельствует о чувствительности к определенной дозе интерферона, а ИЧ меньше или равный 1,0 — об отсутствии чувствительности к интерферону. Известный способ обеспечивает эффективность интерферонотерапии у больных раком почки, однако существенным недостатком способа является то, что помимо интерферона другие иммуноактивные препараты не рас­сматривались.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ индивидуального подбора иммунокоррегирующих препаратов у больных папилломатозом гортани [13], включающий забор периферической крови, получение лейкоцитарной суспензии, инкубирование суспензии клеток с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37 °С, запись кривых люминол-зависимой хемилюминесцентной реакции и расчет индекса стимуляции препарата по соотношению интенсивности хеми­люминесценции в пробе с препаратом к интенсивности хемилюминесценции в контрольной пробе. Препаратом выбора считают иммунокоррегирующий препарат, индекс стимуляции которого выше 1,1. Известный способ не обеспечивает достаточную точность, так как при осуществлении способа выделяют лейкоцитарную взвесь, что влияет на физиологическое состояние клеток и, соответственно, снижает точность результата определения; в качестве хемилюминесцентного индикатора используется люминол, который вступает в хемилюминесцентную реакцию с широким спектром активных молекул [14], что может привести к появлению дополнительной хемилюминесценции, не связанной непосредственно с лейкоцитами, и снизить точность результата определения. Кроме того, недостатком известного способа является то, что способ реализован только для больных папилломатозом гортани.

В таблице представлены показатели контрольной хемилюминесцентной кривой и хемилюминесценции, модифицированной иммуноактивными препаратами. Обнаружено, что статистически достоверно на воздействие изменяется площадь хемилюминесцентной кривой. В связи с этим в разрабатываемом методе оценки чувствительности к иммуноактивным препаратам мы основывались на соотношении площадей спонтанной и модифицированных хемилюминесцентных кривых.

Задача достигается тем, что способ индивидуального подбора иммуноактивных препаратов при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний включает хемилюминесцентное исследование цельной гепаринизированной крови с использованием люцигенина в качестве хемилюминесцентного индикатора, запись кривых спонтанной и модифицированной иммуноактивными препаратами люцигенин-зависимой хемилюминесцентной реакции с последующим расчетом коэффициента иммуноактивной модификации (КИМ) по формуле КИМ = [(SМОД- SСП) / SСП ] × 100 %, представляющей собой процентное соотношение разности площадей под кривой хемилюминесценции, модифицированной исследуемым иммуноактивным препаратом (SМОД). и кривой спонтанной хемилюминесценции (SСП) к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции.

Для проведения иммунотерапии выбирают препарат с максимальной величиной КИМ. При величине КИМ, равной или выше 25 %, прогнозируют эффек­тивную иммунотерапию, а при величине КИМ ниже 25 % — неэффективную иммунотерапию.

Пример 1. Больная М., 56 лет (амбулаторная карта № 67). Клинический диагноз: рецидивирующий фурункулез. В течение трех лет фурункулы на руках, туловище. Неоднократно лечилась (антибактериальная терапия, местное лечение). При проведении иммунологических исследований выявлен Т-лимфоцитоз без нарушения распределения между субпопуляциями Т-лимфоцитов, снижение фагоцитарной активности клеток.

До начала лечения проведен подбор иммуноактивного препарата invitro (циклоферон, тимоген, реафе- рон, галавит, полиоксидоний) согласно заявляемому способу. Наибольшая величина КИМ выявлена при тестировании галавита: 37,5 % (выше 25 %). Прогноз — эффективная иммунотерапия данным препаратом.

Проведено лечение галавитом в рекомендованных общетерапевтических дозах. После проведенного лечения состояние больной улучшилось. Фурункулы отсутствовали. Дальнейшее наблюдение в динамике в течение 6 месяцев: рецидивы не отмечались.

Пример 2. Больная У., 21 год (амбулаторная карта № 95). Клинический диагноз: вирусный гепатит С, генотип 1, хроническое течение. Хронический гепатит С выявлен при заборе крови на донорском пункте. В течение года лечилась без существенного эффекта. Были жалобы на слабость, недомогание. При биохимических исследованиях AJ1T 112-130-126 ед/л, ACT 58-65-60 ед/л. При проведении иммунологических исследований выявлена Т-лимфоцитопения за счет популяции Т-эффекторов, снижение фагоцитарной активности клеток.

До начала лечения проведен подбор иммуноактивного препарата invitro (циклоферон, тимоген, реаферон, галавит, полиоксидоний) согласно заявляемому способу. Наибольшая величина КИМ выявлена при тестировании реафероном — 28,3 % (выше 25 %). Прогноз — эффективная иммунотерапия данным препаратом.

Проведено лечение реафероном в общетерапевтических дозах. После проведенного лечения состояние улучшилось. Стойкая клинико-лабораторная ремиссия в течение 6 месяцев. Жалоб нет. Дальнейшее наблюдение в динамике в течение 6 месяцев: рецидивы не отмечались, AЛT 35-32 ед/л, ACT 28-15 ед/л.

Пример 3. Больной М., 60 лет (амбулаторная карта № 66). Клинический диагноз: хронический двухсторонний гнойный гайморит. Жалобы на головные боли, усиливающиеся при наклоне вперед, заложенность носа, гнойные выделения из носа, снижение обоняния, субфебрилитет. Из анамнеза известно, что пациент страдает хроническим гайморитом более 7 лет. На протяжении этого времени периодически проводились курсы консервативного лечения (антибиотики, симптоматическая терапия). Последнее обострение началось 10 дней назад. По месту жительства проводилось лечение: антибиотики, санационные мероприятия, симптоматические средства. При проведении иммунологических исследований выявлена лейкопения, Т-лимфоцитопения без нарушения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов.

До начала лечения проведен подбор иммуноактивного препарата invitro (циклоферон, тимоген, реаферон, галавит, полиоксидоний) согласно заявляемому способу. Наибольшая величина КИМ выявлена при тестировании тимогеном — 12,1 % (ниже 25 %). Прогноз — неэффективная иммунотерапия данным препаратом.

Проведено лечение тимогеном в общетерапевтических дозах. После проведенного лечения состояние больного улучшилось. У больного прошли головные боли, уменьшилось чувство тяжести в области лица, нормализовалась температура тела. Гнойных выделений не было. Больной был выписан. Однако через 4 месяца у больного началось обострение: головные боли, гнойное отделяемое из носа, температура до 37,5.

Разработанный способ позволяет осуществить подбор эффективных иммуноактивных препаратов при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Технический результат от реализации предложенного способа заключается в следующем: упрощение способа за счет отмены трудоемкой операции по получению лейкоцитарной суспензии; малый объем отбираемой крови для реализации способа, что позволяет осуществлять забор крови из пальца пациента; повышение точности и объективности результата определения за счет отсутствия этапа пробоподготовки с фракционированием клеток и использования люцигенина в качестве хемилюминесцентного индикатора, не вступающего в хемилюминесцентную реакцию с широким спектром активных молекул; возможность индивидуального подбора иммуноактивных препара­тов при лечении широкого спектра инфекционно-воспалительных заболеваний; возможность прогнозирования эффективности иммунотерапии, что позволя­ет исключить применение неэффективных иммуноактивных препаратов.

 

Библиографические ссылки

  1. Практические аспекты диагностики и лечения иммунных нарушений: руководство для врачей: моно- граф. / В. А. Козлов [и др.]. Новосибирск: Наука, 2009.
  2. Ярилин А. А. Иммунология: моног. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.
  3. Alves-Filho J. С., Spiller F., Cunha F. Q. Neutrophil paralysis in sepsis // Shock. 2010. Vol. 34, Suppl. 1. P. 15-21.
  4. El Kebir D., Filep J. G. Role of neutrophil apoptosis in the resolution of inflammation // ScientificWorld Journal. 2010. № 10. P. 1731-1748.
  5. Neutrophil kinetics in health and disease / C. Summers [et al.] // Trends Immunol. 2010. Vol. 8. P. 318-324.
  6. Использование специфических антигенных препаратов в качестве индукторов дыхательного взрыва лейкоцитов крови при хемилюминесцентном анализе / Н. А. Дорохина [и др.] // Клиническая лабо­раторная диагностика. 2001. № 1. С. 39-43.
  7. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о ней- трофиле и макрофаге: моног. Новосибирск: Наука, 1989.
  8. Изменение функциональной активности лейко­цитов крови у здоровых людей при воздействии N6-ц и к ло гс кс и ладе но з и на invitro / А. А. Савченко [и др.] //Иммунология. 2000. № 5. С. 39-41.
  9. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Оценка основных этапов фагоцитарного процесса: современные подхо­ды и перспективы развития исследований // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1995. № 3. С. 3-10.
  10. Тотолян А. А., Фрейдлин И. С. Клетки им­мунной системы: моног. СПб.: Наука, 2000.
  11. Пат. RU 2216739 Способ подбора иммуно­корректора и прогнозирования эффективности имму­нотерапии при урогенитальных инфекциях / Юцков- скаяЯ. А. [и др.]. Опубл. 20.11.2003.
  12. Пат. RU 2293988 Способ оценки чувстви­тельности к интерферону у больных раком почки / Куртасова JI. М. [и др.]. Опубл. 20.02.2007.
  13. Пат. RU 2320991 Способ индивидуального подбора иммунокоррегирующих / Матела И. И. [и др.]. Опубл. 27.03.2008.
  14. Владимиров Ю. А., Проскурина Е. В. Сво­бодные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. 2009. Т. 49. С. 341-388.

        

 

 

 

 

 

 

 

комментарии (0)

Вход в систему Регистрация →
Забыли пароль?